Бактерии Delftia acidovorans выделяют вещество, способствующее биоминерализации золота

Группа канадских ученых обнаружила новый механизм нейтрализации бактериями токсичных для них ионов золота. Оказалось, что бактерии Delftia acidovorans, обитающие на поверхности золотых самородков, выделяют специальное вещество, переводящее ионы золота из раствора в частицы металлического золота. Это вещество — пептид дельфтибактин — избирательно связывается с ионами золота даже если в среде обитания бактерий много ионов других металлов. В отличие от своих собратьев по среде обитания — бактерий Cupriavidus metallidurans, которые нейтрализуют ионы золота, накапливая его внутри клетки, бактерии Delftia acidovorans выделяют дельфтибактин во внешнюю среду, в результате чего золото образуется вне клетки.

Микроорганизмы приспособились к существованию в практически любых условиях, встречающихся на нашей планете. При этом многие из них не просто «терпят» неблагоприятную среду, а «подстраивают» ее под себя. Для этого они выделяют во внешнюю среду специальные вещества (так называемые вторичные метаболиты), чтобы воздействовать на нее и сделать ее более комфортной. Иногда такие вещества могут оказаться полезными и для человека. Хороший пример — антибиотики, которые синтезируются многими микроорганизмами, чтобы избавляться от конкурентов, претендующих на ценные ресурсы. Многие из этих природных соединений нашли применение в медицине в качестве антибактериальных агентов.

При исследовании организмов, населяющих экстремальные для жизни местообитания (экстремофилов), ученых прежде всего интересуют механизмы приспособления этих организмов к условиям внешней среды. Например, благодаря открытию термофильных бактерий Thermus aquaticus, обитающих в горячих источниках при температурах выше 55°C, биологи добавили в свой арсенал ДНК-полимеразу из этого организма, способную работать при высоких температурах (до 96°C). Теперь этот фермент имеется в любой биологической лаборатории, поскольку он незаменим для ПЦР — реакции, позволяющей синтезировать большое количество копий определенной ДНК.

Экстремофилы, способные обитать в окружающей среде с высокими концентрациями тяжелых металлов и их солей, называются металлотолерантными организмами. Для бактерий, населяющих поверхность золотых самородков, характерным условием среды является высокая концентрация ионов золота Au3+, которые токсичны для живых организмов. Поэтому каждый вид таких бактерий обладает механизмом защиты от присутствующих в больших количествах токсичных ионов золота. Так, для грамотрицательной бактерии Cupriavidus metallidurans, одного из двух преобладающих видов микроорганизмов в биопленках на золоте, механизм защиты уже был известен: эти организмы поглощают ионы Au3+ и обезвреживают их, превращая в нетоксичное нерастворимое золото, гранулы которого накапливаются в цитоплазме бактерии (то есть происходит его биоминерализация).

Говоря о биоминерализации, учёные имеют в виду способность живых организмов к образованию минералов, причём слово «минерал» в данном контексте понимается достаточно широко (см. обзор: Steve Weiner, Patricia M. Dove. An Overview of Biomineralization Processes and the Problem of the Vital Effect, PDF, 1,58 Мб). Биоминерализация — это в том числе биогенное образование самородков, металлических руд и т. п. В последние годы появилось много интересных исследований в этой области, что отчасти связано с развитием микроскопических методов. Учёные увидели, что многие руды содержат в себе остатки клеток бактерий (см.: Wang et al., 2011. Molecular biomineralization: toward an understanding of the biogenic origin of polymetallic nodules, seamount crusts, and hydrothermal vents), что может говорить о биогенном происхождении этих руд (месторождений никеля, меди и т. п.). А на поверхности многих руд и самородков были обнаружены растущие бактериальные плёнки.

Другой вид, живущий на золоте, — грамотрицательная бактерия Delftia acidovorans, — до сих пор был практически не исследован и механизм его защиты от избытка ионов золота не был известен даже в общих чертах. Изучением этого загадочного микроорганизма и занялись канадские ученые из Университета Западной Онтарио и Университета Макмастера.

В первую очередь необходимо было выяснить, где происходит восстановление ионов золота: снаружи или внутри клеток. Для этого исследуемые бактерии вырастили на питательной среде, а затем залили раствором солей золота Au3+. Вокруг бактерий образовался темный осадок нерастворимого золота, что говорило о том, что ионы золота эти микроорганизмы восстанавливают снаружи от себя (рис. 2). Когда тот же опыт проделали с Cupriavidus metallidurans, нерастворимого золота вокруг бактерий не образовывалось, так как эти микроорганизмы восстанавливают золото внутри своих клеток.



Поскольку оказалось, что Delftia acidovorans восстанавливает золото снаружи своих клеток, исследователи предположили, что для этих целей бактерия выделяет во внешнюю среду какое-то специальное вещество. Необходимо было выявить гены Delftia acidovorans, ответственные за синтез этого вещества. Важной зацепкой служило то, что у Cupriavidus metallidurans, которая восстанавливает золото внутри своих клеток и потому не выделяет для этой цели специальных веществ наружу, таких генов быть не должно было.

Как правило, для «настройки» условий внешней среды бактерии используют низкомолекулярные вещества особой структуры — либо поликетиды, либо нерибосомные пептиды. Полекитеды — это сложные органические вещества, которые синтезируются специальными ферментами из небольших молекул органических кислот. Нерибосомные пептиды, в отличие от обычных пептидов, синтезируются, как это ясно из названия, не рибосомами, а особыми ферментами, каждый из которых может синтезировать только один тип пептида.

Предположив, что соединение, восстанавливающее золото, у Delftia acidovorans относится к одному из этих типов химических веществ, исследователи начали поиск генов, кодирующих ферменты для их синтеза. С помощью компьютерного анализа генома Delftia acidovorans ученым удалось выявить кластер генов, которые могли кодировать ферменты для синтеза поликетидов или ферменты для синтеза нерибосомных пептидов. Чтобы выявить, действительно ли эти гены имеют отношение к восстановлению золота, исследователи «выключали» их работу путем вставок небольших фрагментов ДНК в последовательность гена.

Обнаружилось, что после «отключения» одного из генов, кодирующих нерибосомную пептид-синтетазу, — этот ген назвали delG — бактерии перестают образовывать вокруг себя осадок нерастворимого золота, даже если ионов золота вокруг них очень много. Значит, именно этот пептид, который обычно образовывался при нормальной работе гена, кодирующего пептид-синтетазу, и восстанавливал золото вокруг бактерий. Таким образом исследователи открыли ген, защищающий бактерии Delftia acidovorans от избытка ионов золота. При нормальной работе этого гена образуется нерибосомная пептид-синтетеза — фермент, который синтезирует пептид, выделяющийся из бактерии и переводящий золото вокруг нее в нерастворимую безвредную форму.



Сравнив содержание экстрактов из бактерий с «выключенным» и «включенным» геном delG, исследователи выявили пептид, который отсутствует у первых и присутствует в значительных концентрациях у вторых. После выделения и очистки этого пептида его структуру удалось установить методами масс-спектрометрии и ЯМР. Пептид получил название дельфтибактин (delftibactin, рис. 3).

Чтобы подтвердить защитную функцию найденного пептида, исследователи вырастили бактерии с «выключенными» генами delG, добавили раствор солей золота, а также дельфтибактин. При избытке солей золота в среде рост бактерий подавлялся, но через некоторое время после добавления дельфтибактина нормальный рост бактерий восстанавливался, что говорило о том, что токсическое воздействие ионов золота устранено.



Авторы изучили свойства этого интересного пептида. Выяснилось, что он способен работать в присутствии солей других металлов, помимо золота (рис. 4). Дельфтибактин успешно работает при высоких концентрациях ионов железа, причем восстанавливает в таких условиях преимущественно золото. Специфичность достигается благодаря тому, что дельфтибактин образует комплексы с ионами металлов, и именно под размер иона золота он «подходит» лучше всего.




С помощью ЯМР-анализа была установлена структура комплексов дельфтибактина с ионами металлов (роль ионов металла выполняли ионы галлия; золото нельзя было использовать, так как с ним дельфтибактин быстро соосаждается, и образуется много нерастворимого материала, что существенно затруднило бы анализ методом ЯМР). Комплексы дельфтибактина с галлием (рис. 6) осаждали золото на порядок хуже, чем чистый дельфтибактин (рис. 5), что подтверждало гипотезу о том, что галлий связывается с теми же группами дельфтибактина, с которыми могло бы связаться золото, и что структура комплексов дельфтибактина с этими двумя металлами сходная. При образовании комплекса с ионом металла молекула дельфтибактина изгибается и связывается с ионом при помощи сразу нескольких боковых групп. После того, как ион связался с молекулой дельфтибактина, может происходить его восстановление. Оставалось выяснить, по какому механизму оно происходит.



При исследовании различных вариантов дельфтибактина из разных штаммов Delftia acidovorans исследователи обнаружили вариант, отличающийся от основного наличием дополнительной метильной группы у одного из центров связывания металла (этот вариант назвали дельфтибактин В). От наиболее распространенного дельфтибактина А этот вариант отличался пониженной реакционной способностью. Эта находка выявила, какая из частей молекулы дельфтибактина восстанавливает золото. Авторы предположили, что восстановление происходит посредством окислительного декарбоксилирования — это объясняет, почему молекула с более реакционноспособной формамидной группой лучше восстанавливает золото, чем молекула с ацетамидной группой (рис. 7).



Авторы данного исследования прошли большой путь от полного незнания того, как Delftia acidovorans защищается от избытка ионов золота в окружающей среде, до открытия соединения, осаждающего золото, и выяснения механизма работы этого соединения. Дельфтибактин — первый обнаруженный секретируемый метаболит, который защищает бактерий от растворимого золота и способствует его биоминерализации (рис. 1). Авторы отмечают, что найденное соединение осаждает золото из раствора его солей намного быстрее и эффективнее, чем известные ранее соединения с подобными свойствами (например, цитрат), и надеются, что их открытие найдет практические применения.

Источник: Chad W. Johnston, Morgan A. Wyatt, Xiang Li, Ashraf Ibrahim, Jeremiah Shuster, Gordon Southam & Nathan A. Magarvey. Gold biomineralization by a metallophore from a gold-associated microbe // Nature Chemical Biology. Published online 03 February 2013. Doi:10.1038/nchembio.1179